Quantificação de Proteínas em Pesquisa Laboratorial

Eu percebi que estou no Butantan a um bom tempo, mas nunca fiz postagens de ciências biológicas aqui, então decidi colocar as anotações que eu faço no laboratório para o desenvolvimento do meu projeto aqui!

Temos que saber quanta proteína tem dentro da amostra, por isso fazemos a dosagem

BCA, BRADFORD E ABSORBANCIA 280 NM

BCA E BRADFORD: Colorimétricos, de acordo com a cor que fica a reação. Cria-se uma curva padrão de concentração da proteína. + Absorbância = + concentração. Começa-se usando uma proteína com concentração conhecida (soroalbumina).

Estruturas da proteína:

Primária: linha de aminoácidos. Sequência linear de aminoácidos. São ligados por uma ligação peptídica. Sequenciamento de proteínas para entender.

Secundária: como eles se organizam, como se dá a ligação/troca de energia entre aminoácidos. Laço peptídeo com oxigênio e hidrogênio. Alpha helix (espiral, hidrogênio bond, except first and last, proline destroys the bond) ou beta sheet (different polypeptide, paralelo ou antiparalelo,) (formatos/estruturas)

Terciária: como o dobramento da proteína se dá. Arranjo da proteína em 3D. Tem outras formas de interação (iônica, etc).

Quaternária: quando tem mais de uma unidade proteica. Interação com outras unidades/estruturas proteicas

A dosagem leva em consideração a estrutura das proteínas. De acordo com a característica escolhe o melhor método

BCA: reage com com ligação peptídica (aminoácido ligado com aminoácido), ácido com ions de cobre. Quando esses íons de cobre se ligam a essas ligações, forma uma reação de complexo cúprico (que é colorido). As limitações são: se detecta ligação pep.; se a proteína for muito fechada, só identifica as ligações do lado de fora. Se for uma proteína pouco fechada vai reagir demais, o que é ruim. Usa-se numa proteína não muito fechada (mediana) e nem muito grande (não pode ser quaternária). Tem que ser pouca ligação.

Bradford: reagente que fica colorido chamado CBB, esse reagente marca aminoácidos que tem na estrutura um anel aromáticos. Quando tem isso, o reagente identifica, reage e forma a cor. A limitação é se a proteína não tem esses aneis aromáticos/esses aminoácidos específicos. 

Como descobrir a concentração: após a reação, com algum dos dois testes

Dosar por absorbância: 280 UV dá pra ver proteína pois ela absorve energia e devolve isso. Com base no espectro de luz dá pra ver a quantidade de proteína. Não precisa de curva padrão, vai usar a própria proteína para se ter isso. Se passar muita luz, tem menos proteína. Se passar menos luz, tem mais proteína